布氏杆菌荧光定量PCR检测试剂盒

产品编号:
产品编号:BS1001 参考价格:48次 2400元
产品特点:采用精准的探针法荧光定量检测,确保准确性;本试剂盒采用实时荧光PCR方法检测牛、羊、猪、马等牲畜的乳腺、淋巴结等组织病料和阴道分泌物、精液等液体病料中的布氏杆菌(BS)。适用于布氏杆菌感染的辅助诊断。试剂盒为预混体系,此体系包含荧光 PCR 检测所需的核酸扩增酶、反应 buffer 及特异性引物和探针,加入提取的样品 DNA 并补足 20 μL 体积的水后即可直接进行荧光 PCR 检测。
产品概述:

产品特点:采用精准的探针法荧光定量检测,确保准确性;

布氏杆菌荧光 PCR 检测试剂盒

使用说明书

用途

本试剂盒采用实时荧光PCR方法检测牛、羊、猪、马等牲畜的乳腺、淋巴结等组织病料和阴道分泌物精液等液体病料中的布氏杆菌(BS)。适用于布氏杆菌感染的辅助诊断。试剂盒为预混体系,此体系包含荧光 PCR 检测所需的核酸扩增酶、反应 buffer 及特异性引物和探针,加入提取的样品 DNA 并补足 20 μL 体积的水后即可直接进行荧光 PCR 检测。

原理

Taq 酶的作用下,经高温变性、中温退火及延伸的循环,使特异 DNA 片段的拷贝数放大,经荧光素标记的探针与扩增的 DNA杂交,利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性,使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离,发出特异性荧光信号,利用荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号,根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。

储存条件及有效期

核酸提取试剂室温保存(蛋白酶K需要放置-20℃保存),扩增反应试剂置于-20℃保存。试剂盒有效期为12个月,避免反复冻融。

目录号JC1001

包装规格:48/

 

组分

包装

核酸提取试剂

结合液CB

11 mL

抑制物去除剂IR

27 mL

漂洗液WB

15 mL(第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀)

洗脱液EB

15 mL

异丙醇

7 mL

蛋白酶K20 mg/mL

20mg冻干粉

吸附柱AC

48

收集管(2mL

48

扩增反应试剂

布氏杆菌荧光PCR引物探针Mix

50 μL/2.0 mL棕色离心管

布氏杆菌荧光PCR Premix

500 μL/1.5 mL离心管

阳性对照

250 μL/1.5 mL离心管

阴性对照

250 μL/1.5 mL离心管

灭菌水

200 μL/1.5 mL离心管

试剂盒组成

操作步骤

1、样品前处理

1.1组织样品:每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1 g,手术剪剪碎混匀后取0.05 g于研磨器中研磨,加入1.5 mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取上清液200 μL1.5 mL灭菌离心管中;

1.2将拭子用无菌生理盐水沾湿,收集阴道分泌物、流产物、阴茎分泌物、眼鼻分泌物样品。再将拭子插入无菌生理盐水(多余部分掰断,盖好盖子),涡旋震荡混匀,取上清200 µL1.5 mL灭菌离心管中;

1.3精液、尿液、乳汁、关节炎和水囊瘤液直接取200 μL1.5 mL灭菌离心管中。

2、 DNA提取

2.1上述1.5mL离心管中加入200 µL结合液CB,立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀,再加入20 µL蛋白酶K (20 mg/mL)溶液(第一次使用蛋白酶K加入1mL灭菌水),充分混匀,70℃放置10 min

2.2冷却后加入100 µL异丙醇,剧烈颠倒轻摇充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。

2.3将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10,000 rpm离心30 s,倒掉收集管中的废液上述各步骤中适当力度充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15s混匀)。

2.4加入500 μL抑制物去除剂IR12,000 rpm 离心30 s,弃废液。

2.5加入700 μL漂洗液WB请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30 s,弃掉废液。

2.6加入500 μL漂洗液WB12,000 rpm 离心30 s,弃掉废液。

2.7将吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm离心2 min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

2.8取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50 μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热),室温放置3-5 min12,000 rpm 离心1 min

2.9 DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃

3、 检测步骤

3.1试剂的准备

从试剂盒中取出扩增反应试剂,冰上融化并振荡混匀后,10,000 rpm离心10 s

设所需要的PCR反应管管数为NN=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:

试剂

每个反应加入的量

N个反应加入的量

布氏杆菌荧光PCR引物探针Mix

1 uL

N+1µL

布氏杆菌荧光PCR Premix

10 uL

10×N+1µL

H2O

4 uL

N+1µL

计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10,000 rpm离心10 s,向设定的NPCR反应管中分别加入15 μL荧光PCR反应液,向每管中加入处理后样品/阴性对照/阳性对照5 μL10,000rpm瞬时离心10秒。

3.1 qPCR 反应循环条件设置

步骤

循环数

温度

时间

荧光通道

1

1

95

0:30

 

2

40

95

0:5

 

60

0:30

收集FAM荧光

 

4、 结果说明

 

4.1结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

4.2试验有效判定

阳性对照的Ct值应小于30并出现特定扩增曲线。阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线。

4.3结果描述及判定

4.3.1 阴性判定

Ct 值并且无特定扩增曲线。

4.3.2 阳性判定

Ct 值≤35,且出现特定扩增曲线,样本判定阳性。

4.3.3 可疑判定

对于Ct 值>35的样本,如没有对数扩增曲线,则判为阴性;如有对数扩增曲线则判为可疑,可疑样本建议重提核酸后再次扩增。重做结果如仍是可疑,则判为样本阳性;否则判为阴性。


技术参数:
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